實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細(xì)胞簡介：

人食管癌成纖維分離自食管癌組織；食管癌是常見的消化道腫瘤，每年約有30萬人死于食管癌。其發(fā)病率和死亡率各國差異很大。我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，每年平均病死約15萬人。男多于女，發(fā)病年齡多在40歲以上。食管癌典型的癥狀為進(jìn)行性咽下困難，先是難咽干的食物，繼而是半流質(zhì)食物，后水和唾液也不能咽下。成纖維細(xì)胞(Fibroblast)是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，由胚胎時期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來。成纖維細(xì)胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯。成纖維細(xì)胞功能活動旺盛，細(xì)胞質(zhì)嗜弱堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動，在一定條件下，它可以實現(xiàn)跟纖維細(xì)胞的互相轉(zhuǎn)化；成纖維細(xì)胞對不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損的修復(fù)有著十分重要的作用。剛分離的成纖維細(xì)胞呈圓形、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中。30min細(xì)胞貼壁，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起；6h后細(xì)胞基本貼壁，伸展成梭形，胞核清晰，分布較均勻，散在生長，不聚集成團(tuán)；細(xì)胞生長迅速，5-7天即呈融合狀態(tài)，細(xì)胞排列緊密，有的交叉重疊生長，平坦、胞體較大，細(xì)胞質(zhì)透明，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，顏色淡。細(xì)胞融合，并彼此連接成網(wǎng)狀；細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。

方法簡介：

實驗室分離的人食管癌成纖維采用 - 膠原酶混合酶消化后差速貼壁制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的人食管癌成纖維經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣

傳代特性：可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

人食管癌成纖維體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項：

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現(xiàn)象。觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細(xì)胞可以消化，懸浮細(xì)胞直接混勻收集細(xì)胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑?，個別敏感細(xì)胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細(xì)胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠蛋白激酶抑制因子γ(PKIγ)檢測試劑盒 ，英文名： PKIγ ELISA Kit

L phenylalanine ammonia lyase (PAL) ELISA Kit 人L苯解氨酶(PAL)檢測試劑盒

RatIerleukin5,IL-5ELISAKIT 大鼠白介素5(IL-5)檢測試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

CLIAKitforCyclin-D3ELISAKit大鼠細(xì)胞周期素D3

細(xì)胞色素P450亞酶CYP2C19(CEC)活性熒光定量檢測試劑盒20次

RatFibronectin,FNELISAKit大鼠纖連蛋白(FN)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

DLL1重組大鼠 DLL1 / Delta-like Protein 1 蛋白 (Fc 標(biāo)簽) Protein

CRF (Corticotropin-Releasing Factor 0.5mgCRF (Corticotropin-Releasing Factor) 促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子

AGO3重組人 AGO3 / Argonaute 3 / EIF2C3 蛋白 Protein

IL17RC Protein Human 重組人 IL17RC 蛋白 (aa 1-454, His 標(biāo)簽)

EPOR Protein Mouse 重組小鼠 EPOR 蛋白

CRF (Corticotropin-Releasing Factor 0.5mgCRF (Corticotropin-Releasing Factor) 促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子

IL17RC Protein Human 重組人 IL17RC 蛋白 (aa 1-454, His 標(biāo)簽)

DLL1重組大鼠 DLL1 / Delta-like Protein 1 蛋白 (Fc 標(biāo)簽) Protein

EPOR Protein Mouse 重組小鼠 EPOR 蛋白

AGO3重組人 AGO3 / Argonaute 3 / EIF2C3 蛋白 Protein

豚鼠免疫球蛋白E(IgE)ELISA 試劑盒 96T/48T

Human cytotoxin associated protein A (CagA) ELISA Kit 人細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(CagA)檢測試劑盒

Humanai-cardiolipinaibodyIgM,ACA-IgMELISAKit 人抗心0脂抗體IgM(ACA-IgM)檢測試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

Humancaneouslymphocyte-associatedaigen,CLA檢測試劑盒人皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CLA)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

組織EPHB3激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20次

humanprogestinandadipoQreceptorfamilymemberⅦ,PAQR7ELISAKit人孕同和adipoQ受體家族成員Ⅶ(PAQR7)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

人食管癌成纖維細(xì)胞三(羥甲基)基鹽酸鹽   100g

is,Hydrochloride   500g

曲拉通X-100   100ml

itonX-100   250ml